Tecnica CRISPR

La tecnica CRISPRS è una tecnica di editing genomico. L'acronimo CRISPR sta per "Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats" e identifica una tecnica di ingegneria genetica usata in biologia molecolare.

Si basa su una versione semplificata di un sistema di difesa contro i virsus che si trova nei batteri (CRISPR-Cas9).

Fornendo la nucleasi Cas9 complessata con un RNA guida sintetico (gRNA) in una cellula, il genoma della cellula può essere tagliato nella posizione desiderata, consentendo la rimozione dei geni esistenti e/o l'aggiunta di nuovi in ​​vivo^[1].

La tecnica è considerata molto significativa nel campo della biotecnologia e della medicina poiché consente di modificare i genomi in vivo in modo molto preciso, economico e semplice. Può essere utilizzato nella creazione di nuovi medicinali, prodotti agricoli e organismi geneticamente modificati o come mezzo per controllare agenti patogeni e parassiti. Ha anche possibilità di uso nel trattamento delle malattie genetiche ereditarie e delle malattie derivanti da mutazioni somatiche come il cancro. Sebbene ampiamente accettata in ambito agrario e biotecnologico, il suo utilizzo nella modificazione genetica della linea germinale umana è ad oggi molto controverso.

Lo sviluppo della tecnica è valso a Jennifer Doudna ed Emmanuelle Charpentier il Premio Nobel per la Chimica nel 2020^[2].

Funzionando come una forbice genetica, la nucleasi Cas9 apre entrambi i filamenti della sequenza del DNA bersaglio per introdurre la modifica. Le mutazioni knock-in, facilitate tramite la riparazione diretta per omologia (HDR, è il meccanismo che nelle cellule ripara le lesioni della catena del DNA), rappresentano il percorso tradizionale degli approcci mirati di editing genomico^[3]. Questo consente l’introduzione di fattori di riparazione mirati del DNA. L'HDR impiega l'uso di sequenze di DNA simili per guidare la riparazione della rottura attraverso l'incorporazione di DNA esogeno che funzioni come modello di riparazione^[3]. Questo metodo si basa sul verificarsi periodico e isolato di danni al DNA nel sito target. Le mutazioni knock-out causate da CRISPR-Cas9 derivano dalla riparazione della rottura del doppio filamento mediante giunzione finale non omologa (NHEJ) o giunzione finale mediata da POLQ/polimerasi theta (TMEJ). Questi percorsi di unione delle estremità in natura possono spesso provocare delezioni o inserzioni casuali nel sito di riparazione, che possono interrompere o alterare la funzionalità genetica. Pertanto, l’ingegneria genomica di CRISPR-Cas9 offre ai ricercatori la capacità di generare un’interruzione genetica casuale mirata evitando inserzioni o delezioni non efficaci.

Sebbene l’editing del genoma nelle cellule eucariotiche sia possibile, utilizzando vari metodi sin dagli anni ’80, i metodi utilizzati prima della tecnica CRISPR si sono rivelati inefficienti e poco pratici da implementare su larga scala.

Con la scoperta di CRISPR e in particolare della molecola nucleasi Cas9, è diventato possibile effettuare un editing efficiente e altamente selettivo. La nucleasi Cas9 è derivata dalla specie batterica Streptococcus pyogenes ed ha facilitato la modifica genomica mirata nelle cellule eucariotiche consentendo un metodo affidabile per creare una rottura mirata in una posizione specifica designata dai filamenti guida di crRNA e tracrRNA^[4]. La facilità con cui i ricercatori possono inserire Cas9 e RNA modello per silenziare o causare mutazioni puntiformi in loci specifici si è rivelata preziosa per la mappatura rapida ed efficiente di modelli genomici e processi biologici associati a vari geni in una varietà di organismi eucarioti. Sono state sviluppate varianti di nuova progettazione della nucleasi Cas9 che riducono significativamente l'attività fuori bersaglio^[5].